Entwicklung und Validierung von Bioassays: die USP-Monographien <1032>, <1033> und <1034>

Bioassays stellen in Bezug auf die Entwicklung, Validierung und die Anwendung des statistisch-mathematischen Rüstzeugs eine besondere Herausforderung dar, da in der Regel mit weitaus größeren Schwankungen zu rechnen ist als bei "traditionellen" quantitativen Bestimmungsmethoden wie z.B. der HPLC. Die USP hat in der USP 35-NF 30, (erstes Supplement) drei neue allgemeine Kapitel zur Entwicklung und Validierung von Bioassays veröffentlicht, die seit diesem Jahr gültig sind (siehe Ankündigung der USP "New & Revised USP–NF Standards for Biologics").

Im Folgenden sind die "General Chapter" <1032>, <1033> und <1034> der USP inhaltlich kurz zusammengefasst:

USP <1032> Design and Development of Biological Assays
Diese neue Monographie beleuchtet Vorgehensweisen zur Entwicklung von Bioassays (z.B. in vivo, ex vivo, zellbasiert), die auf Basis eines geeigneten Design Daten liefern, die mit sinnvollen statistischen Methoden analysiert und ausgewertet (Probe gegen Referenzstandard) werden können. Hinter "sinnvolle statistische Methoden" verbirgt sich u.a. der Wechsel vom Test auf Unterschiede (z.B. der Steigungen) zum Test auf Äquivalenz.

Zielgruppe dieser Monographie sind Bioanalytiker (Informationen zum statistischen Hintergrund) und Statistiker (Informationen zum Hintergrund der Bioanalytik).

Kapitel 4, welches die statistischen Aspekte beleuchtet und dabei auch auf Systemeignungstests und Ausreißer eingeht, macht mit 6 Seiten den Hauptteil dieser Monographie aus. Hier wird ausführlich auf die Verwendung von Äquivalenztests zur Prüfung auf Parallelität (Äquivalenz der Steigungen) als Ersatz für die klassische (und in der Sache falsche) Prüfung auf Unterschiede der Steigungen (t-Test) eingegangen.
Kapitel 5 beleuchtet auf 4 Seiten systematisch die Stufen und Schritte der Entwicklung eines Bioassays: Assay-Design, Assay-Entwicklung, Datenanalysen, Validierung (Verweis auf USP <1033> und Assay-Pflege (über die Lebensdauer des Bioassays).

USP <1033> Biological Assay Validation
In der Einleitung werden Fokus und Besonderheiten von Bioassays für GMP-Zwecke beleuchtet. Trotz der erhöhten Variabilität biologischer Systeme für Freigaben, aber auch für Studien zur Charakterisierung von Produkt, Prozess und Referenzmaterialien eine adäquate Assay-Qualität (Genauigkeit und Zuverlässigkeit) erforderlich. Validierung ist der Prozess, mit dem gezeigt und dokumentiert wird, dass die für den definierten Zweck erforderliche Assay-Qualität und damit die Assay-Eignung gegeben ist.
Im Kapitel 1 werden als Qualitätsmerkmale: relative Richtigkeit, Spezifität, intermediäre Präzision und Arbeitsbereich diskutiert. Die für Routineanwendungen erforderliche Robustheit sollte Ergebnis der Assay-Entwicklung sein und ggf. in den kritischen Aspekten im Rahmen der Validierung demonstriert werden. Die "Linearität" ist in die Messungen zur Richtigkeit integriert, die "intra-assay-Präzision" in die intermediäre Präzision.

Kapitel 2 beleuchtet die Grundlagen der Bioassay-Validierung mit den Schwerpunkten

• Design der Validierungsstudie
• Validierungsstrategien für die Leistungsmerkmale relative Richtigkeit, Spezifität, intermediäre Präzision und Arbeitsbereich
• Setzen von Akzeptanzkriterien (rationale Ableitung aus dem Methodenfähigkeitsindex Cpm und Schätzwerten für die Produkthomogenität, den systematischen Assay-Fehler und die Assay-Streuung
• Assay-Pflege über die Lebensdauer des Assays
• Statistik (Besonderheiten der Logarithmierung (z.B. geometrisches Mittel, geometrischer Variationskoeffizient), Konfidenzintervalle, Akzeptanzbewertung unter Berücksichtigung der Konfidenzintervalle, Irrtums-Risiken der Validierungsstudie und (aus der Streuung abgeleitete) Schätzung von Stichprobenumfängen, Varianzanalyse, Versuchsplanung (Modelle zum Design of Experiments)).

Kapitel 3 macht mit einem kompletten Beispiel zur Validierung eines Bioassays den Hauptteil dieser USP-Monographie aus. Im Anhang wird auf die Besonderheiten logarithmischer Transformation von Messwerten (Berechnung von Mittelwert und Streuung log-normalverteilter Werte) eingegangen.

USP <1034> Analysis of Biological Assays
Nach einer kurzen Einleitung (mit einem Verweis auf die USP-Monographie <1010>) wird ein kurzer Überblick über die während Entwicklung und Validierung eines Bioassays durchzuführenden Datenanalysen gegeben.

Das folgende Kapitel 3 (mathematische Modelle) beschreibt auf 6 Seiten für verschiedene Situationen (Datenarten) mit dem Ansatz "Parallel Line" und 3 weiteren Ansätzen die Modelle und Formeln zur Ermittlung der Potency aus den Messwerten von Bioassays.

Kapitel 4 beschreibt die Ermittlung der Konfidenzintervalle.

Der Anhang enthält auf 6 Seiten ein ausführliches Glossar (sicher auch mit dem Hintergedanken der Harmonisierung der Begrifflichkeit).